Caracterización molecular mediante marcadores ISSR de una colección de 50 árboles clonales e híbridos de cacao (Theobroma cacao L.) de la UNAS-Tingo María

Abstract

Los programas de mejoramiento genético requieren de herramientas versátiles y de bajo costo que permitan lograr en menor tiempo nuevas variedades. En el caso del cacao, se disponen de una serie de técnicas moleculares que facilitan el trabajo al fitomejorador. Sin embargo, la utilidad y conveniencia de tales, serán elegibles dependiendo de las condiciones y objetivos del trabajo. Por este motivo, se trazaron los objetivos de ensayar los marcadores ISSR, determinar su poder discriminante y determinar parámetros de diversidad genética en una colección de cacao de Tingo María. Ésta consistió en 50 individuos o accesiones, de diversas procedencias genéticas y geográficas. El ISSR es una técnica basada en PCR que amplifica el fragmento entre dos secuencias de microsatélites, utilizando un iniciador complementario a éstos. Las muestras fueron colectadas en la provincia de Leoncio Prado (región de Huánuco) donde los árboles de cacao se mantienen en dos ubicaciones: el Banco de Germoplasma de la Universidad Nacional Agraria de la Selva y de la Estación Experimental Agrícola Tulumayo. Según el origen geográfico, se separaron 44 accesiones en dos poblaciones y once subpoblaciones. Las restantes seis accesiones no fueron incluidos en el análisis poblacional dado su origen híbrido. Se colectaron hojas sanas de uno o dos árboles clonales y se almacenaron en silicagel. Se determinaron preliminarmente los protocolos adecuados de extracción de ADN, PCR, y electroforesis con 4 accesiones: ICS1, CAT4, U70 y EET223; se experimentaron con estos genotipos con 59 iniciadores ISSR disponibles en las mismas condiciones PCR. Resultaron 13 primers ISSR con un perfil de amplificación aceptable, de los cuales se eligieron los 5 mejores para amplificar las 50 muestras. El análisis de datos se hizo con dos grupos de datos: un grupo abarcó los 50 OTUs totales y el otro grupo consistió en 6 híbridos Bioversity/UNAS con sus 11 parentales (total: 17). El análisis multivariado y genético se realizó utilizando tres paquetes estadísticos: NTSYSpc v2.1p, Arlequín v3.1 y POPGENE v1.32. Con el primer programa, se realizaron los análisis de agrupamiento (UPGMA-Jaccard) y ordenación (PCoA y nmMDS), así como los de validación (prueba de Mantel), logrando una diferenciación de cacao Nacionales vs. Internacionales, así como una distribución espacial entre parentales y su respectiva progenie.

--- In order to obtain new crop varieties in shorter time, plant breeding programs require versatile and inexpensive tools. For cacao crop, there are available a number of molecular techniques that support the breeder’s job. Nonetheless, work objectives and laboratory conditions determine the utility and convenience of those techniques. In this research, the aim was to test the discriminatory power of ISSR molecular markers in a cacao collection in Tingo Maria, and to determine its genetic diversity. Fifty cacao accessions from different geographical and genetic origin constituted the sampled collection. The ISSR markers consist in DNA fragments amplified by PCR located between two adjacent microsatellite (SSR) loci with the same but inverted sequence. A single primer complementary to these microsatellite sequences is used. The leaf samples were collected from two locations at the Leoncio Prado province (Huanuco region): from the cacao germplasm bank of the Universidad Nacional Agraria de la Selva, and from the Agricultural Experimental Station “Tulumayo”. A hierarchical grouping into 2 populations and 11 subpopulations of 44 accesions was performed taking into consideration the accession geographical origin. The remaining six accessions were excluded due to their hybrid origin. Leaves in good condition were sampled from one or two clonal trees. Then, they were kept and dried in silicagel. As a preliminary assay, DNA extraction and PCR amplification were carried out with four accessions: ICS1, CAT4, U70 and EET223. A group of 59 available ISSR primers were tested with these genotypes and 13 of them gave adequate amplification profiles. Then, five primers were selected and used to amplify the 50 accessions. Multivariate analyses were carried out separating 2 groups of data: the total 50 accessions constituted one group and the second group constituted by six Bioversity/UNAS hybrids and eleven parentals (total: 17 individuals). Three software packages were utilized: NTSYSpc v2.1p, Arlequin v3.1 and POPGENE v1.32. Grouping and ordination analysis, and internal validations were done with the first software.