Selección y validación de genes endógenos normalizadores de la expresión de genes de interés a partir de transcriptomas de estadios tempranos del desarrollo de Paralichthys adspersus

Abstract

El lenguado fino Paralichthys adspersus, de alto valor comercial por su cotizada carne, afronta diferentes problemas durante las primeras etapas de su desarrollo relacionados a malformaciones y altas tasas de mortalidad; por lo que la aplicación de técnicas moleculares para la mejora en su cultivo resulta importante a fin de satisfacer su gran demanda. En este sentido, el trabajo buscó seleccionar y validar genes endógenos para la normalización de genes de interés en los primeros estadios de desarrollo de P. adspersus. Estos genes han sido identificados en datos de transcriptomas y seleccionados considerando valores de expresión diferencial in silico. Así, se evaluaron cinco genes candidatos a endógenos, como codificantes de la proteína ribosomal 40S S4 (RPS4/40S-RP), proteína ribosomal 60S P2 (RPP2/60S-RP), factor de elongación alfa 1a1 (EEF1A1), proteína ribosomal 40S S30 (FAU) y b-actina (bAct); y cinco genes relacionados al desarrollo como, la proteína parecida a formina 1 (Form1) y forkhead box protein B1 (Foxb1) y al crecimiento BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3-like (BCL2), Osteocalcina (Osteo) y proteína 5 de unión al factor de crecimiento parecido a insulina (IGFbp5). Se diseñaron cebadores específicos para siete genes, excepto FAU, bAct e IGFbp5. Los análisis de validación se realizaron utilizando cDNAs obtenidos de ejemplares de 20, 40, 60 y 90 dpe (n=10 por estadío). Las evaluaciones de eficiencias de amplificación de cada marcador se realizaron para todos los genes. Los valores Ct analizados utilizando tres algoritmos estadísticos (geNorm, NormFinder y Bestkeeper) permitieron calcular la estabilidad de cada gen, donde la combinación de 40S-RP + 60S-RP + bAct resultó ser la más estable. El perfil de los genes relacionados al desarrollo (Form1 y Foxb1) mostró una sobreexpresión en el grupo pre metamórfico (20 dpe), opuesta a los relacionados al crecimiento (BCL2, IGFbp5, Osteo) quienes se sobreexpresaron durante y luego de la metamorfosis (40, 60 y 90 dpe). Los perfiles de expresión de ciertos genes de interés cambiaron significativamente (p valor < 0.05) al ormalizarlos con genes inestables (FAU + EEF1A1). Finalmente, los genes evaluados son los primeros marcadores reportados para P. adspersus resultando potenciales para ser utilizados su monitoreo durante estadios tempranos.