Caracterización molecular y clonamiento de una fosfolipasa A2 ácida del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox y su relación en la miotoxicidad

Abstract

Las fosfolipasas A2 (PLA2) del veneno de las serpientes, son enzimas con una variedad de efectos biológicos, los cuales son atribuídos a sus diferentes isoformas ácidas y básicas. Algunas son: anticoagulantes, miotóxicas o neurotóxicas, siendo la miotoxicidad uno de los efectos más graves. Además, el clonamiento y expresión de una proteína recombinante es una herramienta importante para entender la estructura-función de una proteína, por ello, el objetivo de la presente investigación fue purificar, caracterizar y evaluar la actividad miotóxica de una isoforma nativa de PLA2 ácida (denominado BaPer-PLA2a) de B. atrox así como clonar y expresar su forma recombinante. Para ello, se purificó la proteína nativa en tres pasos cromatográficos usando DEAE-Sephadex-A50, Sephadex-G75 y un sistema cromatográfico automatizado líquido de presión media (MPLC). La enzima BaPerPLA2a tuvo una actividad específica de 34.1 U/mg y un peso molecular de ~14.5 kDa por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Asimismo, se aisló el RNA total para la síntesis de cDNA y se obtuvo una longitud de 372 pb. Se dedujo de la secuencia de cDNA una proteína madura de 124 aminoácidos con un pI teórico de 4.41, evidenciando una isoforma ácida. La estructura primaria de esta proteína presenta regiones conservadas en el centro catalítico His48, Asp99, Tyr73 y Tyr52, en el loop de unión al Ca2+ Tyr28, Gly30, Gly32 y Asp49 y la presencia de siete enlaces disulfuro, perteneciendo por tanto a la clase D49PLA2. El modelo teórico estructural de la isoforma tiene una homología del 76.5 % con la PLA2 ácida de B. jararacussu (PDB: 1U73.1A). Asimismo, la BaPer-PLA2a no presenta actividad miotóxica, no obstante, al combinarla con la isoforma de PLA2 básica incrementó la actividad de esta última en 21.58 %. Adicionalmente, el gen fue insertado en el vector pPicZαA y se usó para la transformación y propagación a Escherichia coli, cepa Top10F´, llegando a obtener un inserto de rPLA2a de ~500 pb lo que indica que el clonamiento fue exitoso. Por otro lado, se usó a Pichia pastoris cepa GS115 en los ensayos de expresión de la proteína recombinante, lo cual no se evidenció debido a la optimización en algunos parámetros.