Proliferación de células madre espermatogoniales de alpaca (Vicugna pacos) en presencia de matrices extracelulares

Abstract

La importancia de las células madre espermatogoniales (SSC) radica en su capacidad de autorenovación y diferenciación, dando lugar a la espermatogénesis, es por esto que se busca la proliferación In vitro de este tipo de células ya que representan un pequeño porcentaje de la población celular en testículos de machos adultos y poderlas emplear en la preservación de especies. Debido a la problemática reproductiva que presenta la alpaca en sus condiciones naturales, el empleo de SSC de alpaca surge como una alternativa para conservar la genética de individuos de esta especie. En este contexto, el objetivo de este trabajo de investigación fue cultivar células madre espermatogoniales de alpaca en presencia de moléculas como la gelatina y DBA y evaluar cuál de los distintos métodos provee un mayor soporte para la proliferación de las SSC. Se procesaron 12 pares de testículos de alpaca que fueron colectados en el Camal Municipal de Huancavelica (Aprox. 3,600 msnm), seleccionadas según la evaluación de sus parámetros espermáticos (concentración, viabilidad y movilidad espermática). Las suspensiones celulares obtenidas luego del aislamiento fueron purificadas por gradientes de Percoll y se evaluó la población de SSC por medio del marcaje con DBAFITC por Microscopía de Fluorescencia (MF) y Citometría de Flujo (CF), obteniéndose un porcentaje de células madre espermatogoniales post Percoll de 49.68 ± 10.9% y 83.72 ± 8.5% por MF y CF, respectivamente los cuales fueron mucho mayor a sus respectivos iniciales de 22 ± 5.45% (MF) y 46.52 ± 17.84% (CF), siendo esta diferencia estadísticamente significativa por ambas metodologías (p<0.05). Con respecto a la viabilidad celular no se ve afectada por el empleo del Percoll (p>0.05), siendo 94.89 ± 6.73% y 91.33 ± 6.58% antes y después del Percoll, respectivamente. Las células obtenidas antes y después de la purificación fueron cultivadas en placas normales (Grupo control y Grupo Percoll, respectivamente) y en placas cubiertas con gelatina y DBA (Grupo gelatina y Grupo DBA, respectivamente). Durante el monitoreo de los cultivos, la viabilidad celular entre grupos de tratamiento no se vio afectada significativamente (p>0.05), sin embargo, se observó disminución en la viabilidad entre días de cultivo siendo significativamente diferente entre el día 0 y 3 del cultivo para todos los grupos de tratamiento. Además, se observó la formación de colonias de SSC en todos los grupos al día 3 de cultivo, excepto en el Grupo control, donde la formación de estas fue mínima. Sin embargo, estas colonias empezaron a desaparecer al sexto día de cultivo. Luego de 8 días de cultivo se evaluó el porcentaje de SSC entre los distintos tratamientos por MF y CF, obteniéndose un mayor porcentaje de SSC en el Grupo DBA (63.28 ± 5.61% y 66.9 ± 10.34%) y el menor para el Grupo Control (44.48 ± 6.34% y 52.60 ± 23.44%), siendo los porcentajes intermedios para el Grupo Percoll (52.38 ± 5.64% y 57.95 ± 20.2%) y Gelatina (46.36 ± 4.14% y 53.05 ± 17.73%). Siendo el primer porcentaje obtenido por MF y el segundo por CF, se encontró que el Grupo DBA muestra diferencia significativa con respecto a los demás tratamientos por Microscopía de Fluorescencia (p<0.05), sin embargo, por Citometría de Flujo no se encontró diferencia significativa entre tratamientos (p>0.05). Se concluye que el empleo de gradientes de Percoll es un buen método para la purificación de SSC y que el empleo de la lectina DBA puede soportar la proliferación In vitro de SSC de alpaca.